【实验原理】

EDU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替T渗入正在复制的DNA分子，通过基于EDU与Apollo®荧光染料的特异性反应检测DNA复制活性，通过检测EDU标记便能准确地反映细胞的增殖情况。EDU检测方法更快速、更灵敏、更准确。EDU检测染料在细胞内很容易扩散，无需DNA变性（酸解、热解、酶解等）即可有效检测，可有效避免样品损伤，在细胞和组织水平能更准确地反映细胞增殖等现象。

【实验方法】

Step1: 细胞预处理：按实验设置准备处理细胞。

Step2: EDU标记：将EDU工作液与培养基1:1混合，加入待检样品中，置于37℃饱和湿度、含5% 二氧化碳的培养箱中培养一段时间。

Step3: 细胞固定：EDU标记完成后，用4%的多聚甲醛室温固定15-20min。

Step4: 细胞通透：细胞固定完成后，用0.3%的TritonX-100室温通透10-15min。

Step5: EDU检测：加Click反应液室温避光孵育至镜下看到荧光。

Step6: Hoechst33442染色：室温避光孵育10min。

Step7: 结果分析：图像获取及结果分析。

案例展示

图1：EDU检测镜下荧光图

结果分析：

1.  细胞状态良好，镜下染色颜色清晰，无非特异性着色。

2. EDU标记（即绿色荧光细胞葛素）随处理不同有多少的差异。

技术总结

【常见问题与注意事项】

1、EDU的浓度与孵育时间有关，短时间（小于4h）宜采用高浓度（20-50μM），长时间（大于24h）宜采用低浓度（1-10μM）

2、EDU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用4h-6h孵育时间。

3、EDU反应液应现配现用，孵育时间一般约为室温30min-2h。

4、贴壁细胞宜采用荧光检测方式，适用于荧光显微镜、共聚焦显微镜、高内涵筛选仪检测。悬浮细胞可用涂片方式荧光检测，亦可采用流式细胞仪分析，流式细胞仪需要具备相应荧光通道

5、染色完成后立即进行检测；如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天，若为细胞爬片或涂片，可使用抗荧光淬灭封片后4℃保存及进行检测。

文章出自：实验外包   想了解更多请关注：http://www.dj-cro.com/